การจำลอง DNA

การจำลอง DNA แยกสายเดิมและใช้แต่ละสายเป็นแม่แบบสร้างคู่ใหม่ จึงได้ DNA ลูกที่มีสายเดิมหนึ่งสายและสายใหม่หนึ่งสาย DNA polymerase ยืดได้เฉพาะทิศ 5′→3′ ทำให้สองสายใหม่ที่ replication fork สังเคราะห์ต่อเนื่องเหมือนกันไม่ได้

พื้นฐานที่ใช้: DNA สองสายจับคู่ A–T/G–C และวาง antiparallel; เซลล์คัดลอก DNA ก่อนแบ่ง

เข้าใจเนื้อหาและเงื่อนไข

1. แบบจำลองกึ่งอนุรักษ์ได้รับการทดสอบด้วยไอโซโทป

  • การจำลอง DNA ดำเนินไปตามแบบจำลองกึ่งอนุรักษ์ ซึ่งยืนยันได้จากการทดลองแยกมวลความหนาแน่นของ DNA
  • หลักการของแบบจำลองกึ่งอนุรักษ์ (Semiconservative replication):
    • เมื่อสาย DNA เดิมคลายเกลียวและแยกออกจากกัน แต่ละสายจะทำหน้าที่เป็นสายแม่แบบ (template) ตามกฎการเข้าคู่เบส
    • DNA ลูกแต่ละโมเลกุลประกอบด้วยสายเดิม 1 สายและสายที่สังเคราะห์ขึ้นใหม่ 1 สาย
  • การทดลองของ Meselson และ Stahl:
    • การทดลอง: เลี้ยงเชื้อ E. coli ในอาหารที่มีไนโตรเจนหนัก (¹⁵N) จน DNA มีความหนาแน่นสูง จากนั้นย้ายไปเลี้ยงในอาหารที่มีไนโตรเจนเบา (¹⁴N)
    • ผลในรุ่นที่ 1 (Generation 1): พบแถบ DNA ความหนาแน่นกึ่งกลาง (hybrid ¹⁵N/¹⁴N) เพียงแถบเดียว
    • ผลในรุ่นที่ 2 (Generation 2): พบแถบ DNA ความหนาแน่นกึ่งกลางและแถบเบา (¹⁴N/¹⁴N) ในสัดส่วนเท่ากัน (1:1)
    • ข้อสรุป: ผลการทดลองสนับสนุนแบบจำลองกึ่งอนุรักษ์ภายใต้เงื่อนไขทดลองนั้นอย่างชัดเจน
สี่ขั้นแสดง helicase แยก DNA, primase วาง RNA primer, DNA polymerase อ่านแม่แบบ 3′→5′ และต่อสายใหม่ 5′→3′ จากปลาย 3′, จากนั้นเอา primer ออกเติม DNA และ ligase เชื่อมรอยต่อ
ภาพเรียงการจำลอง DNA: เปิดสาย วาง RNA primer ต่อสายจากปลาย 3′ แล้วแทน primer และปิดรอยต่อ
  • จุดสังเกตสำคัญในภาพ:
    • ขั้นตอนและหน้าที่ของเอนไซม์:
      • ขั้นที่ 1: Helicase เปิดเกลียวและแยกสาย DNA เดิมออกเป็นแม่แบบ
      • ขั้นที่ 2: Primase วาง RNA primer เพื่อให้มีปลาย 3′-OH สำหรับเริ่มต่อสาย
      • ขั้นที่ 3: DNA polymerase ต่อสายนิวคลีโอไทด์โดยอ่านแม่แบบ 3′→5′ และสร้างสายใหม่ 5′→3′
      • ขั้นที่ 4: นำ primer ออก เติม DNA แทนที่ และ Ligase เชื่อมรอยต่อ
    • ข้อจำกัดของภาพจำลอง: เป็นแผนผังแสดงหน้าที่หลัก ไม่ใช่ลำดับปฏิกิริยารายละเอียดครบทุกชนิดเซลล์

2. เอนไซม์สร้างสายใหม่จาก primer

  • การจำลอง DNA อาศัยการทำงานร่วมกันของเอนไซม์หลายชนิดเพื่อเปิดเกลียว วาง primer และสังเคราะห์สายใหม่อย่างแม่นยำ
  • หน้าที่ของเอนไซม์และโปรตีนหลัก:
    • Helicase: สลายพันธะไฮโดรเจนเพื่อคลายเกลียวและแยกสายคู่ DNA ออกจากกัน
    • Topoisomerase: คลายแรงบิดเหนือจุดแยก (supercoiling) บริเวณด้านหน้าของ replication fork
    • Single-Strand DNA-Binding Proteins (SSB): เข้าจับกับ DNA สายเดี่ยวเพื่อพยุงไม่ให้สายกลับมาจับคู่กันอีก
    • Primase: สังเคราะห์ RNA primer สายสั้นเพื่อให้มีปลาย 3′-OH อิสระสำหรับเริ่มต่อสายนิวคลีโอไทด์
    • DNA polymerase: นำนิวคลีโอไทด์ใหม่มาต่อเข้าที่ปลาย 3′ ของ primer โดยอ่านสายแม่แบบในทิศ 3′→5′ และสังเคราะห์สายใหม่ในทิศ 5′→3′
  • ความถูกต้องและการตรวจแก้:
    • Proofreading: DNA polymerase มีกลไกตรวจแก้เบสที่ใส่ผิดพลาดและมีระบบซ่อมแซมเพิ่มเติม
    • ข้อจำกัด: ความเที่ยงตรงในการจำลองสูงมากแต่อัตราความผิดพลาดไม่ใช่ศูนย์ จึงยังเกิดมิวเทชันได้

3. leading กับ lagging strand แก้ปัญหาทิศสวนทาง

  • เนื่องจากสายคู่ของ DNA มีทิศสวนทางกัน (antiparallel) และ DNA polymerase สังเคราะห์สายใหม่ได้เฉพาะในทิศ 5′→3′ เท่านั้น จึงทำให้รูปแบบการสร้างสายใหม่ทั้งสองสายต่างกัน
  • ความแตกต่างของสองสายใหม่:
    • Leading strand: สังเคราะห์สายใหม่อย่างต่อเนื่อง (continuous) ไปในทิศทางเดียวกับการเคลื่อนที่ของ replication fork
    • Lagging strand: สังเคราะห์สายใหม่แบบไม่ต่อเนื่อง (discontinuous) ย้อนทิศทางการเปิดของ fork เกิดเป็นชิ้นส่วนสั้นๆ เรียกว่า Okazaki fragments (ซึ่งแต่ละชิ้นยังคงสังเคราะห์ในทิศ 5′→3′)
  • การเชื่อมต่อชิ้นส่วน Okazaki fragments:
    • การเริ่มสร้าง: แต่ละชิ้นส่วน Okazaki ต้องเริ่มจาก RNA primer ของตนเอง
    • การแทนที่และเชื่อมต่อ: ภายหลัง RNA primer จะถูกกำจัดออกและสังเคราะห์ DNA เติมเต็มแทนที่ จากนั้นเอนไซม์ DNA ligase จะเชื่อมรอยต่อของกระดูกสันหลังน้ำตาล-ฟอสเฟต
  • จุดเริ่มต้นการจำลอง (Origin of replication):
    • จำนวน origin ของการจำลองแตกต่างกันตามชนิดสิ่งมีชีวิตและโครงสร้างโครโมโซม (โพรแคริโอตมักมี 1 จุด ส่วนยูแคริโอตมีหลายจุด)
แผนภาพ fork ไปทางขวา: แม่แบบบน 3′→5′ กำกับ leading strand ที่สร้างต่อเนื่อง 5′→3′; แม่แบบล่างมีทิศตรงข้ามจึงสร้าง Okazaki fragments ไปทางซ้าย แต่ละชิ้นยังเป็น 5′→3′ และ ligase เชื่อมรอยต่อ
ที่ replication fork ซึ่งเคลื่อนไปทางขวา leading strand ต่อเนื่องไปทางขวา ส่วน lagging strand สร้างเป็น Okazaki fragments ไปทางซ้าย
  • จุดสังเกตสำคัญในภาพ:
    • ทิศทางการเคลื่อนที่ของ Fork: แสดง replication fork เคลื่อนที่ไปทางขวา
    • Leading strand: แม่แบบบนในทิศ 3′→5′ ทำให้สังเคราะห์สายใหม่ในทิศ 5′→3′ ได้ต่อเนื่องไปทางขวา
    • Lagging strand: แม่แบบล่างสังเคราะห์ Okazaki fragments ในทิศ 5′→3′ ย้อนไปทางซ้าย และเชื่อมด้วย DNA ligase หลัง primer ถูกแทนที่
    • ข้อจำกัดของภาพจำลอง: ลูกศรเน้นแสดงทิศทางการสังเคราะห์ของแต่ละสาย ภาพไม่ได้แสดงเอนไซม์ helicase, primer และโครงสร้าง fork ครบทุกส่วน

ความรู้นี้ใช้กับโจทย์แบบไหน?

ทำนายแถบหลังเปลี่ยนไอโซโทป

สังเกตจากโจทย์: โจทย์ติดฉลากสายเดิมแล้วถามผลหลังหนึ่ง/สอง generation

เลือกวิธีคิด: ติดตามสายเก่า: รุ่นแรกทุกโมเลกุลเป็น hybrid; รุ่นถัดไปแต่ละ hybrid ให้ hybrid หนึ่งและ light หนึ่ง

ดูทิศบนแผนภาพ replication fork

สังเกตจากโจทย์: มีลูกศร fork และปลาย 5′/3′

เลือกวิธีคิด: ใช้ข้อจำกัดสายใหม่ 5′→3′ ก่อน; สร้างต่อเนื่องตาม fork คือ leading ส่วนสร้างเป็นชิ้นคือ lagging

ตัวอย่างโจทย์พร้อมวิธีคิด

ตัวอย่าง 1 · คาดแถบ DNA รุ่นที่หนึ่งและสอง

แบคทีเรียที่มี DNA หนักย้ายสู่อาหารไนโตรเจนเบา หลังหนึ่งรุ่นและสองรุ่นคาดสัดส่วนแถบแบบใด?

  1. รุ่นแรกแต่ละสายหนักเก็บไว้และจับคู่สายเบาใหม่ จึงเป็น hybrid ทั้งหมด
  2. รุ่นสองแต่ละ hybrid ให้โมเลกุล hybrid หนึ่งจากสายหนักเดิม และ light หนึ่งจากสายเบาเดิม
  3. จึงไม่มี heavy ล้วนหลังรุ่นแรก และรุ่นสองมี hybrid/light อย่างละครึ่ง

คำตอบ: รุ่น 1: hybrid 100%; รุ่น 2: hybrid 50%, light 50%

ตรวจเหตุผล: นับสายเก่าที่ติดฉลาก ไม่ได้ถือว่า label เจือจางเป็นครึ่งหนึ่งต่อโมเลกุลแบบสุ่ม

ตัวอย่าง 2 · เลือกสาย leading

ถ้าสายแม่แบบมีทิศ 3′→5′ ไปในทิศเดียวกับ fork ที่เปิด สายใหม่ด้านนั้นสร้างอย่างไร?

  1. polymerase อ่านแม่แบบ 3′→5′ และสร้างใหม่ 5′→3′
  2. ทิศแม่แบบที่ระบุทำให้ polymerase ต่อสายใหม่ตามการเปิดของ fork ได้
  3. จึงต่อเนื่องได้ ต่างจากอีกด้านที่ต้องสร้างเป็นชิ้นสั้นหลายช่วง

คำตอบ: สร้างต่อเนื่องเป็น leading strand ในทิศ 5′→3′

ตรวจเหตุผล: leading/lagging ตั้งชื่อตามความต่อเนื่องเทียบกับ fork ไม่ใช่ทิศของแม่แบบ